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行業(yè)應(yīng)用

乳和乳制品中黃曲霉毒素M1的檢測方案

時(shí)間:2015-11-4 9:50:55      閱讀:2530

    黃曲霉毒素(AFT)是一類化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的化合物,主要由黃曲霉寄生曲霉產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物,在濕熱地區(qū)食品和飼料中出現(xiàn)黃曲霉毒素的機(jī)率最高。存在于土壤、動植物、各種堅(jiān)果中,特別是容易污染花生、玉米、稻米、大豆、小麥等糧油產(chǎn)品,是霉菌毒素中毒性最大、對人類健康危害極為突出的一類霉菌毒素。

1. 試用范圍

牛奶,奶粉,發(fā)酵乳,干酪,奶油等乳制品

2. 方法原理

黃曲霉毒素M1易溶于極性溶劑,因此均勻基質(zhì)中的黃曲霉毒素M1可以通過甲醇/水震蕩分散提取,對于高脂肪/油含量的樣品基質(zhì)加入正己烷予以脫脂。本方法采用免疫親和柱凈化,熒光檢測器測定乳制品中黃曲霉毒素M1

3. 所需設(shè)備和耗材

黃曲霉毒素免疫親和柱

高效液相色譜儀帶熒光檢測器

均質(zhì)機(jī)

水平振蕩器

SPE轉(zhuǎn)接頭及50ml大容量上樣器

電子天平(精度0.02 g)

SPE裝置帶抽真空系統(tǒng)

黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品

PBS 緩沖溶液:稱取1.16 g Na2HPO4,0.20 g KH2 PO48g NaCl0.2 g KCl 溶于900ml水中,用HCLNaOH調(diào)節(jié)pH7.4,然后定容至1000ml

甲醇(色譜純)

乙腈(色譜純)

正己烷(分析純)。

4. 樣品前處理

牛奶樣品

1. 稱取25g(精確至0.01g)混勻的樣品,置于50 mL具塞離心管中,水浴加熱至3537 6000 r/min下離心10min。收集全部上清液,待凈化;

2. 發(fā)酵乳(包括固體狀、半固體狀和帶果肉型)

3. 稱取25g(精確至0.01 g)混勻的樣品,用0.5mol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.49500r/min下均質(zhì)5min,水浴加熱至3537,6000 r/min下離心10min。收集全部上清液,待凈化。

4. 乳粉和粉狀嬰幼兒配方乳制品

5. 稱取10g(精確至0.01 g)樣品置于250 mL燒杯中,加入50mL50 的水于乳粉中,玻璃棒攪拌均勻。溶解后冷卻至室溫,移入100 mL容量瓶中,水洗燒杯并轉(zhuǎn)移洗滌液,用PBS定容至刻度后裝入離心管6000轉(zhuǎn)/分鐘下離心15 min,混合上清液,取50mL上清液待凈化。

干酪

切取均質(zhì)的樣品5g(精確至0.01 g)50 mL離心管中,加2mL水和30 mL甲醇,9500 r/min下勻漿5 min,超聲提取30min,6000r/min下離心10 min。收集上清液并移入250 mL分液漏斗中,同時(shí)加入30 mL正己烷,振搖2 min,分層后,棄去正己烷層。重復(fù)用正己烷提取2次。提取液減壓濃縮至約2 mL,轉(zhuǎn)移濃縮液至離心管,燒瓶用甲醇-水溶液(1+4)5 mL2次洗滌并倒入50mL離心管中,加PBS溶液稀釋至50 mL6000r/min下離心5min,上清液待凈化。

奶油

稱取5g(精確至0.01g)試樣,置于50 mL燒杯中,用20 mL正己烷將其溶解并移于250mL具塞錐形瓶中。加20 mL水和30 mL甲醇,振蕩30min后,將全部液體移于分液漏斗中,待分層后,將下層溶液全部移到100 mL圓底燒瓶中,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至約5 mL,加PBS稀釋至約50mL,待凈化。

5. 免疫親和柱凈化

1. IAC裝于固相萃取裝置上,接上大體積上樣器,10ml PBS溶液活化柱子,流速保持在2–3 ml/min,確保上樣前柱子保留少量(0.5ml)的PBS溶液,活化液不收集;

2. 將待凈化液加入免疫親和柱,流速不超過5 mL/min,不收集流出液;

3. 用約20ml去離子水淋洗柱子,流速不超過5 mL/min,抽真空1分鐘,不收集流出液;

4. 1.5ml甲醇洗脫,流速控制在1d/s,收集洗脫液過膜后上機(jī)測試。

注:免疫親和柱從冰箱去除需升到室溫后使用

6. 色譜條件

色譜柱:  Ultimate? XB-C18 250 mm x 4.6 mm,5μm(上海月旭提供)

預(yù)柱:    Ultimate? C185μm,ULT5BG18(上海月旭提供)

流動相:  :甲醇:乙腈=11:4:5

柱溫:    35

檢測波長: 發(fā)射波長:365nm,激發(fā)波長:450nm

進(jìn)樣量:  100μL  


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