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技術(shù)支持

色譜儀溶劑造成柱效下降和峰分叉的原因說明

時間:2017-4-11 10:21:21      閱讀:2556

 色譜儀柱效下降的表現(xiàn)一般是峰變寬和峰高下降,有的時候會出現(xiàn)分叉峰。造成柱效下降的原因很多,很多時候我們會想到柱子的問題,其實溶劑與流動相的不匹配會造成柱效下降。本文主要說明溶劑造成柱效下降和峰分叉的原因。

一、實驗

儀器:高效液相色譜儀配自動進樣器,UV/vis檢測器;C18色譜柱,4.6×250mm,5μm。

試劑:分析物F(易溶于甲醇和冰醋酸,微溶于乙醇和水,進樣用80%的甲醇溶解),磷酸二氫鈉(分析純),乙睛(色譜純),甲醇(分析純)。

檢測條件:檢測波長214nm,緩沖溶液0.01M磷酸二氫鈉緩沖溶液;流動相:乙腈:緩沖鹽=15:85。進樣體積:100μl。

如圖1,在緩沖溶液pH =5.0時出現(xiàn)分叉峰(圖1),樣品F濃度為2μg/ml。下調(diào)緩沖鹽pH =3.0,仍然出現(xiàn)分叉峰(圖2)。


圖1. pH=5.0色譜圖

 

圖2. pH=3.0色譜圖

同時我們發(fā)現(xiàn)所有的雜質(zhì)峰也都出現(xiàn)了分叉情況(圖3)。

 

圖3. 雜質(zhì)峰也出現(xiàn)分叉

二、原因分析

是什么原因造成了這種現(xiàn)象呢?

首先想到的是大體積進樣造成的(因為進樣20μl不能檢測到所分析物質(zhì)F濃度)進樣100μl一般會造成峰擴展,柱效下降,如果降低進樣量還會出現(xiàn)分叉峰嗎?實驗結(jié)果如圖4。進樣體積減小,峰分叉的情況逐漸改善,在進樣50μl的情況下,形成了肩峰(圖4小圖),進樣40μl肩峰消失。

 

圖4 依次進樣20,40,50,80,100μl的色譜圖。小圖為50μl進樣后積分,該圖顯示色譜峰有肩峰

一般來說,加大進樣體積,峰會展寬很多,分離度降低,柱效下降(極端情況下如果是微柱或者UPLC會看不到峰),不會出現(xiàn)峰分叉,分叉峰是怎么形成的呢?更奇怪的是進樣體積越大,出峰時間越靠前,在進樣100μl和進樣20μl的情況下,出峰時間相差4分鐘,為什么進樣體積會影響出峰時間?

造成這些現(xiàn)象的原因只有一個:溶解分析物F的溶劑,增加進樣體積只是放大了溶劑影響。在我們的實驗中,溶劑采用80%的甲醇溶解,而流動相是15%的乙腈,在反相色譜中,80%的甲醇洗脫能力強于15%的乙腈,就是說溶解F的溶劑極性小于流動相的極性。當樣品進入色譜后,一部分分析物質(zhì)會和固定相結(jié)合,一部分還沒有和固定相結(jié)合就被洗脫能力強的溶劑帶著沿流動方向移動(色譜柱縱軸),這樣分析物就發(fā)生了擴散(圖5擴散),當進樣體積加大,進入色譜系統(tǒng)的溶劑會改變色譜柱的流動相組成,甚至?xí)斕娴袅鲃酉啵▓D5溶劑替代),在溶劑的洗脫下,出峰時間就會提早,溶劑里的分析物F和在色譜過程開始的與固定相結(jié)合的分析物F會先后流出,這樣就形成了分叉峰(圖5檢測)。

 

圖5.溶劑造成的峰擴散和峰分叉過程。橘黃色為溶劑,黑色為分析化合物,淡藍色為色譜

三、結(jié)論

1. 溶解分析物的溶劑最好使用流動相或者洗脫能力比流動相小的溶劑,避免峰展開。

2. 考慮到分析物溶解性,如果選用洗脫能力比流動相強的溶劑,盡量減小進樣體積,避免對色譜造成大的擾動。

3. 如果目標是能檢測2μg/ml的濃度,而現(xiàn)有分析方法的定量限LOQ是10μg/ml,請慎重使用加大進樣量的改進方法,加大進樣量會產(chǎn)生很多意想不到的問題,結(jié)果通常是進樣量加大5倍,LOQ一般不會提高5倍。

(內(nèi)容來源液相色譜之家)

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