色譜儀柱效下降的表現(xiàn)一般是峰變寬和峰高下降，有的時候會出現(xiàn)分叉峰。造成柱效下降的原因很多，很多時候我們會想到柱子的問題，其實溶劑與流動相的不匹配會造成柱效下降。本文主要說明溶劑造成柱效下降和峰分叉的原因。
一、實驗
儀器：高效液相色譜儀配自動進樣器，UV/vis檢測器；C18色譜柱，4.6×250mm，5μm。
試劑：分析物F（易溶于甲醇和冰醋酸，微溶于乙醇和水，進樣用80%的甲醇溶解），磷酸二氫鈉（分析純），乙睛（色譜純），甲醇（分析純）。
檢測條件：檢測波長214nm，緩沖溶液0.01M磷酸二氫鈉緩沖溶液；流動相：乙腈：緩沖鹽=15:85。進樣體積：100μl。
如圖1，在緩沖溶液pH =5.0時出現(xiàn)分叉峰（圖1），樣品F濃度為2μg/ml。下調(diào)緩沖鹽pH =3.0，仍然出現(xiàn)分叉峰（圖2）。
圖1. pH=5.0色譜圖
圖2. pH=3.0色譜圖
同時我們發(fā)現(xiàn)所有的雜質(zhì)峰也都出現(xiàn)了分叉情況（圖3）。
圖3. 雜質(zhì)峰也出現(xiàn)分叉
二、原因分析
是什么原因造成了這種現(xiàn)象呢？
首先想到的是大體積進樣造成的（因為進樣20μl不能檢測到所分析物質(zhì)F濃度）進樣100μl一般會造成峰擴展，柱效下降，如果降低進樣量還會出現(xiàn)分叉峰嗎？實驗結(jié)果如圖4。進樣體積減小，峰分叉的情況逐漸改善，在進樣50μl的情況下，形成了肩峰（圖4小圖），進樣40μl肩峰消失。
圖4 依次進樣20,40,50,80,100μl的色譜圖。小圖為50μl進樣后積分，該圖顯示色譜峰有肩峰
一般來說，加大進樣體積，峰會展寬很多，分離度降低，柱效下降（極端情況下如果是微柱或者UPLC會看不到峰），不會出現(xiàn)峰分叉，分叉峰是怎么形成的呢？更奇怪的是進樣體積越大，出峰時間越靠前，在進樣100μl和進樣20μl的情況下，出峰時間相差4分鐘，為什么進樣體積會影響出峰時間？
造成這些現(xiàn)象的原因只有一個：溶解分析物F的溶劑，增加進樣體積只是放大了溶劑影響。在我們的實驗中，溶劑采用80%的甲醇溶解，而流動相是15%的乙腈，在反相色譜中，80%的甲醇洗脫能力強于15%的乙腈，就是說溶解F的溶劑極性小于流動相的極性。當樣品進入色譜后，一部分分析物質(zhì)會和固定相結(jié)合，一部分還沒有和固定相結(jié)合就被洗脫能力強的溶劑帶著沿流動方向移動（色譜柱縱軸），這樣分析物就發(fā)生了擴散（圖5擴散），當進樣體積加大，進入色譜系統(tǒng)的溶劑會改變色譜柱的流動相組成，甚至?xí)斕娴袅鲃酉啵▓D5溶劑替代），在溶劑的洗脫下，出峰時間就會提早，溶劑里的分析物F和在色譜過程開始的與固定相結(jié)合的分析物F會先后流出，這樣就形成了分叉峰（圖5檢測）。
圖5.溶劑造成的峰擴散和峰分叉過程。橘黃色為溶劑，黑色為分析化合物，淡藍色為色譜
三、結(jié)論
1. 溶解分析物的溶劑最好使用流動相或者洗脫能力比流動相小的溶劑，避免峰展開。
2. 考慮到分析物溶解性，如果選用洗脫能力比流動相強的溶劑，盡量減小進樣體積，避免對色譜造成大的擾動。
3. 如果目標是能檢測2μg/ml的濃度，而現(xiàn)有分析方法的定量限LOQ是10μg/ml，請慎重使用加大進樣量的改進方法，加大進樣量會產(chǎn)生很多意想不到的問題，結(jié)果通常是進樣量加大5倍，LOQ一般不會提高5倍。
（內(nèi)容來源液相色譜之家）
