一、流動(dòng)相的選擇
1、流動(dòng)相的混合
雙泵主要是在探討流動(dòng)相的配比或者梯度洗脫是比較方便，知道確切的液相色譜儀條件時(shí)，建議配好后使用的話，混合比較均勻，效果較好。
2、脫氣
HPLC所用流動(dòng)相必須預(yù)先脫氣，否則容易在系統(tǒng)內(nèi)逸出氣泡，影響泵的工作。
系統(tǒng)中氣泡的產(chǎn)生：流動(dòng)相本身存在，梯度淋洗混合后放出氣泡；
氣泡的影響：存在于管路中，系統(tǒng)壓力不穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有偏差；
存在于單向閥中，易造成液體回流，流量不準(zhǔn)確，甚至是不吸液；
存在于檢測(cè)器中，出現(xiàn)鬼峰，影響檢測(cè)準(zhǔn)確性。
所以做液相對(duì)流動(dòng)相的氣泡和雜質(zhì)要求比較嚴(yán)格。氣泡會(huì)影響柱的分離效率，檢測(cè)器的靈敏度、基線穩(wěn)定性，甚至使無法檢測(cè)。（噪聲增大，基線不穩(wěn)，突然跳動(dòng)）。此外，溶解在流動(dòng)相中的氧還可能與樣品、流動(dòng)相甚至固定相（如烷基胺）反應(yīng)。溶解氣體還會(huì)引起溶劑pH的變化，對(duì)分離或分析結(jié)果帶來誤差�！ �
溶解氧能與某些溶劑（如，甲醇、四氫呋喃）形成有紫外吸收的絡(luò)合物，此絡(luò)合物會(huì)提高背景吸收（特別是在260nm以下），并導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度的輕微降低，但更重要的是，會(huì)在梯度淋洗時(shí)造成基線漂移或形成鬼峰（假峰）。在熒光檢測(cè)中，溶解氧在一定條件下還會(huì)引起淬滅現(xiàn)象，特別是對(duì)芳香烴、脂肪醛、酮等。在某些情況下，熒光響應(yīng)可降低達(dá)95%。在電化學(xué)檢測(cè)中（特別是還原電化學(xué)法），氧的影響更大。除去流動(dòng)相中的溶解氧將大大提高UV檢測(cè)器的性能，也將改善在一些熒光檢測(cè)應(yīng)用中的靈敏度。
常用的脫氣方法有：加熱煮沸、抽真空、超聲、吹氦等。對(duì)混合溶劑，若采用抽氣或煮沸法，則需要考慮低沸點(diǎn)溶劑揮發(fā)造成的組成變化。
（1）氦氣脫氣：氦氣脫氣是很有效的脫氣方法。氦氣緩緩的通過流動(dòng)相趕去溶入的空氣，如果使用得當(dāng)，在10min內(nèi)可除去80%～90%的溶入氣體。由于氦氣在流動(dòng)相中的溶解度極低，所以用氦氣脫氣保護(hù)的流動(dòng)相可以認(rèn)為是一個(gè)無氣體溶解體系。其缺點(diǎn)是氦氣價(jià)格比較昂貴，會(huì)增加檢驗(yàn)成本。一般說來有機(jī)溶劑中的氣體易脫除，而水溶液中的氣體較頑固。在溶液中吹氦是相當(dāng)有效的脫氣方法，這種連續(xù)脫氣法在電化學(xué)檢測(cè)時(shí)經(jīng)常使用。但氦氣昂貴，難于普及。
（2）真空脫氣：也是比較常用的脫氣方法。現(xiàn)在多數(shù)企業(yè)都最常用這種辦法，貯液器被抽成部分真空，溶入的氣體蒸發(fā)形成氣泡溢出，其效果僅次于氦氣脫氣。象Agileng1200液相色譜使用的是在線脫氣機(jī)。在線脫氣只適合脫完氣之后的流動(dòng)相，在使用過程中的微量脫氣。
（3）超聲波脫氣：將配制好的流動(dòng)相連容器放入超聲水槽中脫氣10～20min。這種方法比較簡便，又基本上能滿足日常分析操作的要求，所以，目前仍廣泛采用。這種方法只能除去30%的溶解氣體，有時(shí)還會(huì)引起氣體溶解度的增加。對(duì)氧敏感的檢測(cè)器不宜用此法。
超聲脫氣比較好，10~20分鐘的超聲處理對(duì)許多有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑/水混合液的脫氣是足夠了（一般500ml溶液需超聲20~30min方可），關(guān)于超聲時(shí)間問題眾說紛紜，各實(shí)驗(yàn)室內(nèi)5～30分鐘不等，一般來說流動(dòng)相組成為無機(jī)（緩沖鹽溶液）時(shí)，5～15分鐘即可，流動(dòng)相為是水和有機(jī)容積混合時(shí)，超聲時(shí)間要相對(duì)長一些，這個(gè)方法只能除去30%的溶解氣體，時(shí)間的延長不和效果成正比，且其中氣泡對(duì)色譜峰基線穩(wěn)定性與信噪比有一定影響，一般來說影響不大，15min超聲即可足夠。此法不影響溶劑組成。超聲時(shí)應(yīng)注意避免溶劑瓶與超聲槽底部或壁接觸，以免玻璃瓶破裂，容器內(nèi)液面不要高出水面太多。
（4）加熱回流脫氣：該方法雖然效果很好，但是適用范圍較窄。對(duì)于有機(jī)溶劑或混合流動(dòng)相不適合用此法，因?yàn)閾]發(fā)性組分會(huì)損失掉，改變流動(dòng)相的組成。
綜合來說，用真空抽濾后，再用超聲脫氣還是最常用的辦法，用氦氣的方法是效果最好的辦法，而在線脫氣本身也是真空脫氣，但它可以放到儀器上使用，是一種保證性的辦法。
A.離線（系統(tǒng)外）脫氣法不能維持溶劑的脫氣狀態(tài)，在你停止脫氣后，氣體立即開始回到溶劑中。在1~4小時(shí)內(nèi)，溶劑又將被環(huán)境氣體所飽和。
B.在線（系統(tǒng)內(nèi)）脫氣法無此缺點(diǎn)。最常用的在線脫氣法為鼓泡，即在色譜操作前和進(jìn)行時(shí)，將惰性氣體噴入溶劑中。嚴(yán)格來說，此方法不能將溶劑脫氣，它只是用一種低溶解度的惰性氣體（通常是氦）將空氣替換出來。此外還有在線脫氣機(jī)�！�
注：
1.選用流動(dòng)相配置對(duì)色譜峰影響最小
2.流動(dòng)相溶解度達(dá)不到要求時(shí)，盡量選用流動(dòng)相中含有的比例較大的成分，以減輕進(jìn)樣對(duì)流動(dòng)相的影響造成基線不穩(wěn)。
3.流動(dòng)相組成溶劑均達(dá)不到要求時(shí)，選取的溶劑應(yīng)保證在設(shè)定波長內(nèi)無紫外吸收。
二、流動(dòng)相的PH
如需在一定PH值下操作，須定期測(cè)定流動(dòng)相的PH值，大氣中的CO2溶解在流動(dòng)相內(nèi)將引起PH值的改變，特別是貯液瓶密閉不嚴(yán)時(shí)這種影響可能更大。
三、更換柱子及流動(dòng)相
軟質(zhì)或半軟質(zhì)填料的溶脹率隨溶劑極性的變化而變化，使用新柱時(shí)應(yīng)先用25~30倍柱容積的合適流動(dòng)相平衡。更換流動(dòng)相時(shí)，如果兩種流動(dòng)相不互溶，需采用過渡溶劑使前一種流動(dòng)相逐步溶解除去。例如，2、2、4-三甲基戊烷換成甲醇時(shí)，必須用乙酸已酯或其他溶劑過渡，直到標(biāo)準(zhǔn)物保留值達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。
（內(nèi)容來源實(shí)驗(yàn)與分析網(wǎng)）
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